更新時間:2023-09-26
外泌體電鏡可以直觀的看到粒子的形態,因此可以用于鑒定外泌體的存在和完整性,但是包括支原體、鐵蛋白聚團、聚乙二醇蛋白聚團、溶酶體等的電鏡圖片與外泌體都十分相似,并且電鏡只能展示局部景象。因此,電鏡成像無法區分外泌體及形態相近的納米粒子,且不能反映樣品中的外泌體數量。
1、樣品制備:
收集外泌體樣品:收集細胞培養上清液、生物體液(如血漿、尿液等)或組織液體(如腦脊液等),其中包含外泌體。
預處理:通常需要對樣品進行初步處理,如離心去除細胞碎片和大顆粒物質。
電鏡固定:
固定樣品:使用適當的固定劑(如戊二醛、冷凍固定等)將外泌體固定在其原來的狀態中,以保持其形態和結構。
洗滌:用緩沖液洗滌樣品,以去除過剩的固定劑。
2、脫水和浸透:
脫水:在一系列濃度遞增的乙醇溶液中,逐步將樣品中的水分脫除,以使樣品適應后續的樹脂浸透。
浸透:使用合適的樹脂(如Epon、Araldite等)浸透樣品,使其在固化后具有適合電鏡觀察的硬度和清晰度。
3、樹脂包埋:
預埋:將浸透后的樣品置于埋脂盒中,加入適量的樹脂,并根據需要進行定向。
固化:根據樹脂的不同,采用適當的溫度和時間進行固化,使樣品堅硬并固定在樹脂塊中。
4、超微切片:
準備超薄切片:使用超薄切片機,將樹脂塊切割成約60-90納米厚度的超薄切片。
收集切片:將切片收集在銅或金網格上,以便后續的電鏡觀察。
5、電鏡觀察:
雙重染色:通常首先使用重金屬鹽(如鈾酸和鉛酞)對切片進行雙重染色,以增加對比度。
電鏡觀察:將樣品放置在透射電鏡中,利用電子束通過樣品,觀察外泌體的形態和內部結構。
拍攝圖像:使用透射電子顯微鏡(TEM)或掃描電子顯微鏡(SEM)拍攝外泌體的高分辨率圖像。
外泌體電鏡觀察是一項復雜的技術,需要在專業實驗室中進行。實驗條件和步驟可能會因實驗目的和設備不同而有所變化。為了獲得高質量的觀察結果,建議在進行外泌體電鏡觀察時咨詢專業人士或參考相關文獻。